蛋白表達純化實驗步驟

1、取適當相應蛋白高表達的動物組織提t(yī)otal-RNA。

2、設計蛋白表達引物。引物要去除信號肽,要加上適當?shù)拿盖形稽c和保護堿基。

3、RT-PCR,KOD酶擴增獲取目的基因c DNA.

4、雙酶切,將cDNA.克隆入PET28/32等表達載體。

5、轉化到DH5α感受態(tài)細菌中擴增,提質粒。

6、將質粒轉化入表達菌株,挑菌檢測并保種。表達菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。

7、蛋白的誘導表達。

1)將表達菌株在3ml LB培養(yǎng)基中搖至OD=0.6左右,加入IPTG,濃度梯度從25μM

到1m M。37度誘導過夜(一般3h以上即有大量表達)。

2)SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。注:目的蛋白包涵體表達量一般會達到菌體

2)SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。注:目的蛋白包涵體表達量一般會達到菌體

蛋白的50%以上,在膠上可以看到明顯的粗大的條帶。

3)將有表達的菌株10%甘油保種,保存1ml左右就足夠了,并記錄IPTG濃度范圍。

甘油是用0.22μm過濾除菌的,儲存濃度一般是30%-60%,使用時自己計算用量。

4)用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導10ml表達菌,18度,低轉速(140-180rpm),

誘導過夜作為包涵體檢測樣品。

注意:1.如果表達的蛋白對菌體有毒性,可以在加IPTG之前的培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖用來抑制本底表達。葡萄糖會隨著細菌的繁殖消耗殆盡,不會影響后面的表達。2.

保種可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反復凍融。

8、包涵體檢測。方案見附件2

9、如有上清表達,則擴大搖菌。

1)取保種的表達菌株先搖10ml,37度,300rpm搖至OD>=1.5,約5h左右,視菌種的活性而異,也可過夜搖菌。

2)將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37度,250rpm搖至OD= 1.0左右(約

2.5h~3h),然后加IPTG(濃度同包涵體檢測中使用的濃度。)注:菌液濃度要適當

的濃一些,否則第二天收集不到足夠的菌體,因為低溫低轉速細菌生長非常緩慢。

拿起錐形瓶對光搖動,看到有大量云霧狀菌體即可。另一方法是,將手指放在瓶底晃動,看不清手指為宜,不過此法宜受氣泡影響。

3)過夜搖菌,使用包涵體檢測的溫度(18°左右),轉速140rpm左右。

4)將菌液6000rpm,4min,4度離心收集菌體。加入20mM PBS,洗一遍后用平衡緩

沖液重懸。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡緩沖液,視菌液的濃度而定?？捎?支50ml 的離心管同時離心,但是,離心管要重復使用,用完后洗凈保存。

10、超聲波裂解。

1)用6mm變幅桿,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。

注意:1.要冰浴。2.要隨時觀察裂解情況以防意外。3.要將探頭探入到溶液中下部,盡量不要打出大量氣泡。一般溶液量比較大的時候不會出現(xiàn)大量氣泡。

4.正常聲音為:孜孜聲,尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對或者功率太大或者探頭

4.正常聲音為:孜孜聲,尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對或者功率太大或者探頭

松動等原因,要及時調整。溶液由渾濁變清透,由粘稠變不粘稠表明裂解完成(后面3000轉離心時,如果沉淀少說明裂解的好)。5.超聲波破碎儀工作30分min要休息5min(即關閉總電源開關)。

注意:1.如果純化的蛋白較易被蛋白酶降解,在超聲裂解之前要加蛋白酶抑制劑(PMSF),PMSF 工作濃度為1%。2.如不能判斷是否裂解完全,就按上述條件裂解

60分鐘,60分鐘足夠裂解。

11、取得上清

1)將破碎好的溶液收集到50ml離心管中。10000rpm,15min,4°離心。沉淀為包涵

體、細胞碎片和未破碎的細胞。輕輕的將上清倒出,盡量不要倒出沉淀。(此時可以測量一下pH值,pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就會在7.5左右。)

12、純化上清---摸洗脫條件。

1)鎳柱處理。將1ml鎳柱吸入空層析管中,待其中的液體流完后加入平衡緩沖液3ml。

2)將10ml上清加到已經(jīng)平衡過的NI柱上,并將過柱的樣品重復上樣3次。(若是流

速慢可以在柱子下面加一個針頭,或者用1ml的槍將膠體吹散。)取20μl過柱后的樣品,以備跑膠。

3)分別加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度來洗脫雜蛋白。每個梯度分別

的上樣量為4ml、2ml、2ml、2ml。每個次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP 管中,以備跑膠。

注意:理論上是要將收集的溶液測量280nm處的吸光度,直到吸光度為零時再進行下一個梯度的洗脫。實際上測不到零,怎么都會有一點的,上面說的量已經(jīng)做夠洗脫了。

4)加Elution Buffer 將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml(將前面的0.5ml單獨接入EP

管,再將后面的4ml接入另外兩個EP管),留跑膠樣品。

5)加MES將NI柱重生。MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2

倍體積的20%乙醇中,鎳柱至少能重復利用6次。(尿素可能對NI柱有損傷。)注意:所有溶液使用前都要確定其pH是否正確,pH對掛柱及洗脫影響較大。鎳柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。

倍體積的20%乙醇中,鎳柱至少能重復利用6次。(尿素可能對NI柱有損傷。)注意:所有溶液使用前都要確定其pH是否正確,pH對掛柱及洗脫影響較大。鎳柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。

13、跑膠驗證。

1)跑2塊0.75mm的PAGE膠,把所有的樣品都加上去,注意兩塊膠的濃分離比要相

同兩塊膠才會比較一致。

2)跑膠順序:負對照、正對照、上清、過柱樣品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、

W7、W8、W9、E1、E2、MES

3)300V快速壓膠5min左右,160V分離樣品50min左右。(也可以300V,30min,只是

圖沒有160V好看。)

4)考馬斯亮藍染色。一般染色2h即可。

5)脫色。先用脫色劑1脫15min,再用脫色劑2脫過夜。

14、純化上清---收集目的蛋白

1)將重生的鎳柱再次平衡(即加Equilibration Buffer 3ml)。

2)重復步驟12中的操作,只是wash時只用步驟12中摸好的咪唑濃度洗。

15、跑膠驗證。同步驟13這次膠圖要跑的漂亮一點(用160V),保存好。

16、透析。

1)配制2L透析液(配方見附件1),并放于-20度冰箱預冷但不要結冰。

2)透析袋(剪10cm即可)用透析袋處理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗凈。

3)用透析夾將透析袋夾住(將透析袋折疊一下會夾的更牢),將洗脫的蛋白樣品加入其

中,置入提前預冷的500ml透析液(20mM PBS+50 mM NaCl)中。冰浴下輕微磁力攪拌20min后置入4°冰箱1.5h后換液。透析3次即可。

注意:用廣口瓶裝透析液,將廣口瓶置于裝有冰的2L大燒杯中。冰浴以防活性降低。

17、濃縮。

1)將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中,用預冷的聚乙二醇2000固體包埋。

1)將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中,用預冷的聚乙二醇2000固體包埋。

2)30min后將吸水后呈漿糊狀的聚乙二醇去除,加入新的固體聚乙二醇。

3)每隔10min觀察一次,一旦出現(xiàn)渾濁立即停止?jié)饪s。

4)透析袋用完后,洗凈,保存于20%乙醇中4°存放。

注意:濃縮過度后會有白色小顆粒或絮狀晶體出現(xiàn),由于透析袋使溶液成薄層狀,透明度較高,不易發(fā)現(xiàn)小顆?；蛐鯛畛恋?要看仔細。如果看不到,可根據(jù)自己估計的蛋白量留1-2ml體積。用透析液將透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分裝后-20度保存。

18、超濾法濃縮、透析蛋白。使用超濾法就可省去16、17兩步。

1)將4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超濾管中。

2)配平。

3)7400g,30min,4°離心,結束時4ml變?yōu)?ml左右。濃縮4倍?？筛鶕?jù)需要選擇不同的離心時間,以達到不同的濃縮倍數(shù)?？梢詭状蔚腅lution液一起濃縮。

4)加入需要的蛋白儲存液至4ml,離心。重復操作可以使Elution液逐漸換為所需的蛋白儲存液。蛋白儲存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或適當濃度和pH的tris-HCl

溶液。如果蛋白有沉淀達不到預定濃度可以添加適當?shù)母视?1%-5%即可)助溶。5)收集。將溶液從超濾管中收集到EP管中,標記好儲存液的成分,蛋白名稱,蛋白

濃度(測量后),制備日期。

注:超濾管的使用方法見附件4

19、蛋白濃度測定。見附件3

20、蛋白活性測試。轉染細胞測量熒光。

21、抗原處理。蛋白與弗氏佐劑混合成油包水狀。

22、注射兔子。選擇合適的注射方式和合適的免疫程序。

23、收集免疫血清。提取抗體。

24、抗體效價評定。

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