貨號：10456-1， 包裝：10ML(50次），價格：360元
貨號：10456-2， 包裝：50ML(250次），價格：1400元
英文名稱：Exosome Isolation Kit from Cell Culture Media by Precipitation Method
細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒(沉淀法)
產(chǎn)品簡介：
Proandy生產(chǎn)的細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒(沉淀法) (Exosome Isolation Kit from Cell Culture Media by Precipitation Method)，也稱為細(xì)胞培養(yǎng)液上清外泌體提取試劑盒、外泌體純化試劑盒、外泌體抽提試劑盒、Total Exosome Isolation Kit， 是一種高效、便捷的用于細(xì)胞培養(yǎng)液上清中外泌體或其它細(xì)胞外囊泡提取的試劑盒，僅需簡單的較低速度離心即可從樣品中分離 出大量完整的、純度較高的外泌體。使用本試劑盒提取的外泌體可用于蛋白分析、核酸分析、Western blot、PCR、RNA提取、高通量測序、外泌體粒徑和濃度分析即納米顆粒示蹤分析(Nanoparticle tracking analysis, NTA)、電鏡分析、細(xì)胞共培養(yǎng)等實驗。
外泌體(Exosome)是膜包裹的細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直徑約為40-160nm，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，天然存 在于血液、尿液、腦脊液，以及體外培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中，幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。細(xì)胞膜內(nèi)吞(Endocytosis)依次形成初級內(nèi)體(Early sorting endosome, ESE)、次級內(nèi)體(Late sorting endosome, LSE)和多囊泡體(Multivesicular body, MVB)，其中多囊泡體包含腔內(nèi)囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs)。多囊泡體與細(xì)胞膜融合形成外泌體,外泌體攜帶多種來自其母體細(xì)胞的成分(包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類、糖類和代謝物等)釋放到胞外基質(zhì)中。外泌體可以被附近或遠(yuǎn)距離的細(xì)胞識別和融合，是細(xì)胞間進行相互調(diào)控的重要媒介，參與了癌癥、神經(jīng)退行性病變和炎癥性疾病等多種疾病的發(fā)病過程，影響細(xì)胞多方面的功能。
本產(chǎn)品采用多聚物沉淀法，設(shè)備要求低、操作方便、提取時間短、樣品起始量低、提取效率高、外泌體形態(tài)比較完整.
本產(chǎn)品無RNA酶、無DNA酶、無蛋白酶。使用本產(chǎn)品提取得到的外泌體可以用于RNA、DNA及蛋白的各種應(yīng)用.
按使用說明操作，每次提取1ml樣品需190μl的細(xì)胞上清外泌體提取試劑，本品10ML試劑盒可使用約50次，本品50ML試劑盒可使用約250次。
使用說明：
1. 樣品的準(zhǔn)備。
A.在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)所需細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達70%-80%時(處于對數(shù)生長期)，加入不含外泌體的血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)牡臒o血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12-24小時，待細(xì)胞密度達90%-100%時，收集細(xì)胞上清。 注1：由于血清中含有非常多的外泌體，為了避免污染，此時需要加入不含外泌體的血清。不含外泌體的血清可以通過超速離 心法獲得，也可以直接使用無外泌體的血清。也可以根據(jù)具體的實驗條件，使用不含血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，某些細(xì)胞可無血清正常生長約12個小時，或者增加不含細(xì)胞的培養(yǎng)液組作為陰性對照。 注2：細(xì)胞上清中外泌體的量隨細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)量的差別而有一定的差異，須根據(jù)實驗需求決定樣品的起始量。 注3：細(xì)胞凋亡、死亡過程中會釋放大量囊泡，這些囊泡在外泌體的提取純化過程中會污染活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體，請確保細(xì)胞狀態(tài)良好，凋亡或死亡細(xì)胞占比盡量不超過5%。
B.將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液在4oC，500×g離心5分鐘，輕輕緩慢地吸取上清液至一新的離心管中；再將上清液在4oC，10,000-16,500 ×g離心30分鐘，輕輕緩慢地吸取上清液至一新的離心管中。
C.用0.22μm的針頭濾器(FF342/FF362/FF372)過濾上清液，進一步去掉較大的細(xì)胞囊泡和凋亡小體等雜質(zhì)，將過濾后的上清液 轉(zhuǎn)移至新的離心管中。
D.選做：使用10-100kDa之間的超濾管(如FUF158)對上清液進行濃縮。將濃縮后的上清液從超濾管的死體積收集器中取出，用 于后續(xù)外泌體提取。 注：一些細(xì)胞(干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)分泌的外泌體較少，可以將細(xì)胞上清液體積濃縮10倍左右再進行后續(xù)的外泌體提?。欢鴮τ?外泌體分泌量多的腫瘤細(xì)胞等，可以不進行濃縮或?qū)⒓?xì)胞上清液體積濃縮2-5倍左右在進行后續(xù)的外泌體提取。具體濃縮倍數(shù) 可根據(jù)實際情況進行調(diào)整。
2. 外泌體提取。
A. 每1ml步驟1中準(zhǔn)備好的上清液樣品中加入190μl細(xì)胞上清外泌體提取試劑，吹打混勻后置于4oC，靜置4小時或者過夜。 注：外泌體提取試劑非常粘稠，需緩慢吸取，緩慢加入，并確保外泌體提取試劑與細(xì)胞上清液充分混勻。如果細(xì)胞分泌的外泌 體較少，則可以通過增加靜置的時間以提高外泌體得率。
B. 10,000×g在4oC離心30分鐘，用1ml吸頭小心吸除上清液，盡可能吸凈上清液但不要觸碰沉淀，收集沉淀，即為外泌體。 注：細(xì)胞培養(yǎng)液樣品中外泌體一般含量較少，此時可能肉眼觀察不到沉淀，如果離心時使用角轉(zhuǎn)子，注意標(biāo)記離心管擺放方向， 并在底部位置畫圈標(biāo)識。
C. 離心獲得的外泌體沉淀可用適量的PBS或者生理鹽水重懸，一般10ml細(xì)胞培養(yǎng)液的起始量使用0.1-1ml重懸液進行重懸；也可直接將沉淀用于后續(xù)實驗。 注：外泌體可在4oC保存1周，或在-20℃及更低溫度長期保存。
D. 選做：某些樣品中的非外泌體雜質(zhì)較多，導(dǎo)致沉淀比較多，此時可通過重懸并短暫離心去除雜質(zhì)。將沉淀用適量的PBS重懸， 然后12,000×g在4oC離心2分鐘，取上清。若沉淀較多，可將上清多次12,000×g在4oC離心2分鐘，直至無明顯沉淀。 注1：沉淀可能較難重懸，需反復(fù)多次吹打。 注2：需根據(jù)后續(xù)的純化方法選擇合適的重懸液。
3. 外泌體純化(可選)。
A.獲得的外泌體可通過外泌體純化柱或親和層析法等方法進一步進行純化。
B.若需要獲得無菌的外泌體，則可使用0.22μm的針頭濾器進行過濾。為減少損失，請先將濾器用PBS進行潤洗。若提取的外泌 體暫時不使用，可進行分裝后于-80oC保存.
注意事項：
1---本產(chǎn)品較為粘稠，使用時需完全混合均勻后再吸取，并保證吸取體積準(zhǔn)確。
2---本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
3---為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
保存條件：
4oC保存，一年有效。室溫保存，一個月有效。-20oC保存，至少兩年有效。