Click EdU細胞增殖檢測試劑盒(染料可以定制)

產(chǎn)品組成：

保存條件：
         -20℃保存，一年有效。特異性熒光染料和PI須避光保存

產(chǎn)品簡介：

Click EdU細胞增殖檢測試劑盒(Click EdU Cell Proliferation Kit with Dye)，是一種基于DNA合成過程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入，并通過隨后的點擊反應(yīng)(Click reaction)使EdU被Dye所標(biāo)記，從而實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏地檢測細胞增殖的試劑盒。
本試劑盒可以檢測到細胞或組織樣品中單個的增殖細胞，同時也可以對細胞或組織樣品總體的細胞增殖情況進行定量檢測。本試劑盒可以檢測培養(yǎng)的細胞或組織樣品，也可以檢測組織切片。
經(jīng)本試劑盒處理后，增殖的細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)非常明亮的藍色熒光，可以用于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀（須配有DAPI檢測通道）或熒光酶標(biāo)儀檢測，也可以用于高內(nèi)涵篩選(High-Content Screening, HCS)。流式細胞儀或熒光酶標(biāo)儀檢測僅適用于細胞樣品，不適用于組織切片。
細胞增殖能力的檢測是評估細胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。公認(rèn)的最精確的檢測細胞增殖的方法是直接檢測細胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過檢測DNA合成來檢測細胞增殖的方法是放射性標(biāo)記核苷摻入法，如氚標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷([³H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實現(xiàn)單細胞檢測而受到很大的限制，隨后逐漸被基于抗體檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多，且需要使用BrdU抗體，影響因素較多，穩(wěn)定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體，有時會和其它目的蛋白基于抗體的檢測相互產(chǎn)生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續(xù)的點擊反應(yīng)，無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高，是一種在BrdU法基礎(chǔ)上升級換代的新方法，將會逐步取代BrdU法。
MTT法、WST-1法、CCK-8法和CellTiter-Lumi?化學(xué)發(fā)光法都是基于細胞活性的細胞增殖檢測方法，能檢測到細胞的總體增殖效果，但無法檢測到單個的增殖細胞。這幾種方法盡管都不是檢測DNA合成的，但被廣泛用于替代[³H]thymidine摻入法。CFDA SE法，基于細胞熒光示蹤的原理能檢測到單個的增殖細胞，但由于每增殖一次熒光減弱一半，在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細胞，檢測靈敏度不是很高，通常僅適用于流式細胞儀檢測。在進行科學(xué)研究時，上述這些基于細胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補充性檢測方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine)類似物，EdU可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能與EdU特異性反應(yīng)探針通過一價銅離子的催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點擊反應(yīng)(Click reaction)，通過點擊反應(yīng)，新合成的DNA會被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記，從而可以使用適當(dāng)?shù)臒晒鈾z測設(shè)備檢測到增殖的細胞。

產(chǎn)品特點：

本試劑盒反應(yīng)簡單、檢測靈敏度高。

本試劑盒基于簡單高效的點擊反應(yīng)，無需DNA變性，只需少量的小分子EdU特異性反應(yīng)探針即可非常有效地標(biāo)記出摻入的EdU，并且可以檢測到單個細胞的增殖情況。
本試劑盒使用便捷、兼容性好。

本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使EdU特異性反應(yīng)探針有效進入細胞并發(fā)生點擊反應(yīng)，不會影響細胞形態(tài)，不會影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測，也不會影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測細胞周期)。而BrdU法為了使大分子的BrdU抗體進入細胞并與DNA上的BrdU結(jié)合，需要對雙鏈DNA進行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等)，這種變性可能會影響細胞形態(tài)，影響后續(xù)的免疫熒光和免疫組化檢測、DNA的熒光染色等

本試劑盒檢測快速，定性定量檢測都非常便捷。

相對于至少需要4小時的BrdU法，本試劑盒采用的Click EdU法檢測新合成的DNA只需1.5-2小時，時間上大大縮短。本試劑盒同時提供了染色細胞核的PI，以方便染色觀察所有的細胞核?？梢允褂脽晒怙@微鏡或流式細胞儀等進行定性和定量檢測。本試劑盒小包裝，如果用于培養(yǎng)的細胞(6孔板)的檢測，可以檢測50個樣品，每個樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液；如果用于96孔板檢測，可以檢測500個樣品，每個樣品的檢測體系為50μl的Click反應(yīng)液；如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板樣品的檢測，分別可以檢測125、250、350和1250個樣品，每個樣品推薦的Click反應(yīng)液用量為200μl、100μl、70μl和20μl。小包裝如果用于流式細胞儀檢測，可以檢測50個樣品，每個細胞樣品的細胞數(shù)量宜為10-100萬，每個樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液。小包裝如果用于冰凍或石蠟切片的檢測，可以檢測125-250個樣品， 每個樣品的反應(yīng)體系為100-200μl的Click反應(yīng)液。

注意事項：
Click Additive配制成溶液后請注意適當(dāng)分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出，請上下顛倒多次，待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色，說明該組分的有效成分已失效，請棄用。
由于本產(chǎn)品需要銅離子催化進行點擊反應(yīng)，請注意如下的兼容性問題及解決方案。本產(chǎn)品完全兼容有機類染料如Alexa Fluor^?系列普通染料及fluorescein (FITC)、Allophycocyanin (APC)及APCE-tandems染料；對于Qdot^?納米晶體探針、Horseradish peroxidase (HRP)、R-phycoerythrin (R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor^? 680-R-PE等，需要在點擊反應(yīng)完成后進行反應(yīng)和檢測；本產(chǎn)品會影響GFP、RFP、mCherry等熒光蛋白的熒光，對于熒光類蛋白如Green Fluorescent Protein (GFP)、FlAsH?和ReAsH?類試劑，需要在點擊反應(yīng)前進行反應(yīng)和檢測。由于Phalloidin (鬼筆環(huán)肽)不兼容點擊反應(yīng)，推薦使用進行細胞微管的檢測。

溫馨提示：
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：

1. 需要用戶自行準(zhǔn)備試劑：

1XPBS,固定液，洗滌液，通透液，超純水；蓋玻片等耗材

2.  培養(yǎng)細胞的EdU的標(biāo)記及固定、洗滌和通透（參考）

a. 在6孔板中培養(yǎng)適當(dāng)數(shù)量的細胞。細胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進行所需的藥物處理。

b. 配制2X的EdU工作液：推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。

注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養(yǎng)液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。

c. 將37oC預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?/span>1X。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。

d. 繼續(xù)孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細胞周期10%左右的時間。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當(dāng)降低EdU的濃度。

e. EdU標(biāo)記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1mL固定液(4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。

注意：對于流式細胞儀檢測，貼壁細胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸后再固定。

f. 去除固定液，每孔用1mL洗滌液 (1X PBS) 洗滌細胞3次，每次3-5分鐘(水平搖床緩慢搖晃)。

g. 去除洗滌液，每孔用1mL通透液(0.3% TritonX-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。

h. 去除通透液，每孔用1mL洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘(水平搖床緩慢搖晃)。

3. EdU檢測

a. 配制Click Acceleration Solution：用1.5mL去離子水溶解一管Click Acceleration Reagent，混勻至全部溶解，即為Click Acceleration Solution。配制后可以適當(dāng)分裝，并-20oC保存。

b. 參考下表配制Click反應(yīng)液。注意：請嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，否則點擊反應(yīng)可能無法有效進行；同時，Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。

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